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蓝光驱动蛋白质“侧链重编程”：从精准 C–C 成键到功能探针
给蛋白质加一个荧光标签，可以帮助我们追踪它；但如果希望直接改变某个位点的氨基酸侧链，甚至赋予蛋白新的反应能力，又该如何实现？2020 年，Benjamin G. Davis 与 Véronique Gouverneur 等研究团队在《Nature》报道了一种蓝光驱动的蛋白质翻译后编辑方法：以脱氢丙氨酸（Dha）为预设锚点，通过碳中心自由基与 Dha 反应形成 C–C 键，将多样化天然或非天然侧链引入蛋白质。更重要的是，研究者进一步用这些修饰蛋白研究酶识别、¹⁹F-NMR 检测和蛋白质相互作用，展示了从“化学修饰”走向“功能研究”的可能。原文信息 Josephson, B.; Fehl, C.; Isenegger, P. G. et al. Nature 2020, 585, 530–537. DOI：10.1038/s41586-020-2733-7- 01 位点精准：通过预先设置的 Dha 锚点选择编辑位置
- 02 侧链多样：引入 50 余种天然、非天然及含氟侧链
- 03 应用延伸：面向酶活分析、¹⁹F-NMR 和蛋白交联
蛋白质的氨基酸序列由遗传信息决定，但蛋白的最终功能并不只取决于这条序列。蛋白翻译完成后，赖氨酸乙酰化、甲基化，以及丝氨酸或苏氨酸磷酸化等翻译后修饰（post-translational modifications，PTMs），可以影响其构象、酶活、稳定性、细胞定位和分子间相互作用。在表观遗传研究中，组蛋白不同位点的酰化状态还与染色质调控密切相关。研究 PTM 的一个基础需求，是获得修饰位置明确、化学结构清楚、适于重复实验的蛋白样品。直接从细胞中分离的蛋白往往存在修饰位点和修饰程度的异质性；而在蛋白质上直接引入具有指定结构的侧链，则有助于把某一种修饰与其功能效应对应起来。尤其对于非天然侧链、同位素标记和人工反应手柄，化学合成与蛋白编辑提供了传统细胞表达之外的选择。早期蛋白化学主要利用残基固有的反应活性：半胱氨酸（Cys）上的巯基、赖氨酸（Lys）上的氨基是常见靶点。此类反应易于开展，却可能同时作用于同一个蛋白中的多个相同残基。随后，天然化学连接（NCL）拓展了修饰蛋白的化学合成能力；生物正交反应及“标签—修饰”（tag-and-modify）策略，则借助人工反应基团提高了复杂环境下的选择性。不同技术各有优势，并非简单替代关系。但当问题从“把标记接到蛋白上”变成“在某个残基位置重建一个特定的氨基酸侧链”时，仅完成标签偶联未必足够。理想的编辑反应既要在水相温和条件下进行，又要尽量保留其他敏感基团，还需生成稳定、结构明确的连接键。2016 年，Davis 团队已提出利用自由基 C(sp³)–C(sp³) 成键开展蛋白翻译后化学诱变，为本研究奠定了技术基础。脱氢丙氨酸（dehydroalanine，Dha）可视为带有碳碳双键的非天然氨基酸残基。研究者可先在目标位置引入半胱氨酸，再通过化学消除把该位点转化为 Dha；文献报告中以 DBHDA 处理组蛋白突变体为例说明这一制备路线。Dha 的双键能接受碳中心自由基加成，因而充当“编辑入口”：蛋白主链不必整体重合成，便可以在原先设定的位置形成新的碳基侧链。需要强调的是，Dha 必须预先制备，不能据此认为该方法可直接识别任意野生型蛋白的指定残基。这项工作的思路可以概括为：先预置 Dha → 在光照下生成碳中心自由基 → 自由基与 Dha 双键反应 → 在蛋白上形成新的 C(sp³)–C(sp³) 键。与只在侧链末端接上一个较大的外源标签相比，这种策略能够直接构建氨基酸侧链的碳骨架，因此更接近“翻译后化学诱变”的概念。为何选用光氧化还原反应？自由基可以跨越部分传统离子反应的官能团限制，但蛋白又容易受到氧化、副反应或结构损伤影响。研究者通过约 450 nm 蓝光、钌光催化剂以及适当的氧化还原条件，在水相缓冲体系中实现自由基生成和加成。论文报告的代表性反应通常采用低氧／脱气条件，并需根据前体和蛋白调节用量与条件；这是一套适用于体外蛋白样品的化学方法，而非未经处理的细胞内原位反应。图1｜左上方是两套“生成自由基”的路线。 BAcED 由硼酸类前体与邻苯二酚原位形成，经蓝光激发的水溶性 Ru(II) 光催化体系活化，释放 RCH₂· 型自由基；另一条 pySOOF 路线则利用吡啶基砜衍生物，在 Ru 光催化与 Fe(II) 协同条件下产生 RCF₂· 型自由基。两种自由基最终都加成到 Dha 的碳碳双键上，区别在于：前者形成 β-CH₂–γ-CH₂ 连接，更适于构建不带额外氟标记的天然型侧链；后者形成 β-CH₂–γ-CF₂ 连接，把可用于 ¹⁹F 检测的二氟亚甲基直接纳入侧链。图1｜左下方展示位点编辑过程及代表性条件。 蛋白首先在预定位置带有 Dha；在约 450 nm 蓝光照射下，溶液中生成的碳自由基与 Dha 发生加成，随后通过适当的氧化还原终止步骤得到稳定的 C–C 连接产物。示意图汇总的实验窗口为脱气水相缓冲液、室温、pH 6–8、5–120 min，图中还展示了代表性的 70%–95% 转化率。这些数值是不同条件下的示例范围，不能理解为所有蛋白与试剂都能获得相同收率。值得注意的是，反应并非直接“识别”蛋白中的天然某个 Lys 或 Cys，而是识别研究者预先设置的 Dha 锚点。图1｜右侧回答“是否只适用于单一模型蛋白”。 研究团队以组蛋白 H3（K4、K9、K18、K27 等位置）、H4（K16）为代表，也测试了 AcrA、PanC、NPβ 和 cabLys3 等不同骨架；右下角列出的酰胺、叠氮、醚、酯、卤素及不同氧化态含硫基团等，体现了可保留的官能团类型。论文总计展示 50 余种侧链 的安装。因此图1更重要的结论不是“蓝光能修饰蛋白”这一点，而是选择适当氧化还原窗口后，能够在多类蛋白上较为温和地构建结构多样的碳基侧链。路线 A｜ BAcED：引入接近天然结构的碳基侧链 BAcED 指硼酸邻苯二酚酯（boronic acid catechol ester）类自由基前体。通过原位形成的前体及光氧化还原活化，可产生 RCH₂· 型碳自由基，并在 Dha 处形成包含 β-CH₂–γ-CH₂ 连接的侧链。这条路线的价值，在于能够构建与天然残基或某些 PTM 侧链相近的碳骨架，而不只是额外附着一个检测标签。相应条件可能需要较高的前体用量。另一类是吡啶基砜（pySOOF）前体。论文利用 Fe(II) 配合钌光催化体系，促进含氟碳自由基参与 Dha 加成，形成 β-CH₂–γ-CF₂ 连接。这里的 Fe(II) 还与控制加成中间体的氧化还原命运有关，能够减少不希望出现的氧化副产物。含氟基团相当于在局部结构中安置可被 ¹⁹F-NMR 识别的“信号窗口”，而不是在蛋白上再挂一个体积较大的荧光染料。两条路线对前体浓度的要求差异明显：原论文给出的典型筛选条件中， BAcED 往往使用相对蛋白较大量的前体，而 pySOOF 可在数当量前体条件下实现转化。二者是相互补充的化学工具，适合根据目标侧链和实验需求选择；这些代表性条件不应被理解为对所有底物都适用的固定配方。从组蛋白 H3、H4 到其他不同结构的蛋白骨架，研究共展示了超过 50 种不同侧链／残基的安装，并对酰胺、叠氮、醚、卤素、含硫基团等多种官能团进行了兼容性验证。这说明方法具有一定的底物广度；但“已经安装”与“每一种修饰都保留完整天然生物学活性”是两件事，后者仍需逐一进行功能实验。如果一种修饰方法只能将侧链装入蛋白，其用途主要取决于这一步得到的产物。该研究进一步尝试让新安装的侧链成为下一步化学反应的起点：既能走自由基均裂通道，也能走亲核取代等异裂通道。这是论文题目中“reactive protein side chains（反应性蛋白侧链）”的重要内涵。研究者将 iodo-pySOOF 相关基团安装到 Dha 位置，得到带有可进一步活化侧链的蛋白。通过自由基捕获等实验，作者验证了蛋白结合态自由基中间体能够产生。它既可能引起分子间交联等需要控制的副反应，也为蛋白交联和其他自由基型衍生反应提供了工具基础。图2a｜第一步先把蛋白变成“可再次激活的自由基前体”。 图的最上方从 Dha 标记的组蛋白 H3 出发，使用 iodo-pySOOF 试剂进行光化学安装，得到末端保留 pySOOF 基团的蛋白。两组完整蛋白质谱分别对应 X = H 与 X = F：所示产物的理论/实测分子量为 15,355/15,355 Da 和 15,373/15,373 Da，与预期结构相吻合。这里的质谱证据主要说明预期质量的化学产物已形成；定位到特定位点仍需结合预设 Dha 位点和其他分析条件理解。图2a｜第二步观察蛋白结合态自由基能做什么。 重新活化已安装的 pySOOF 基团后，反应发生在蛋白侧链本身，而不只是溶液中的小分子。图中间以碳中心自由基为分叉点：遇到稳定氮氧自由基 TEMPO 可形成 C–O 连接，遇到二苯基二硒醚（Ph₂Se₂）可形成 C–Se 连接；在适当还原条件下，自由基被终止，形成 C–H 键。相应质谱给出了各类加成或终止产物的特征质量，如图中 TEMPO 捕获产物约 15,403 Da、含硒产物约 15,387 Da，为自由基后续反应提供产物层面的证据。图2a｜图的下半部分强调“均裂化学”带来的扩展性与风险。 该蛋白侧链自由基还可对烯烃受体加成，出现不同加成次数的质谱峰，显示其用于蛋白结合态链增长/寡聚化的潜力；也能与另一分子携带 Dha 的蛋白偶联，左下角凝胶中的更高分子量条带支持蛋白—蛋白共价交联。这说明安装侧链之后仍能进行多种 C–C、C–O、C–Se 成键，但也提醒我们：在设计可控探针时，必须考虑非目标加成、交联与产物分布。利用带有末端溴或碘取代基的 BAcED 前体，研究者在 Dha 位点形成新的 C–C 键，同时保留侧链末端的 C–Br 或 C–I 亲电键；进一步的卤素交换还能获得 C–Cl 侧链。这种设计将“侧链骨架构建”与“后续亲核取代”拆分成两步，使反应后的蛋白能够继续接受硫、氮、磷等亲核试剂的修饰。值得注意的是，这里的“可反应”并非越活泼越好：亲电侧链的反应性、蛋白折叠状态以及潜在非目标反应之间需要平衡。对于需要捕获蛋白相互作用或构建化学探针的场景，这种可调反应性尤其有价值。图3b｜保留碳—卤键，就给蛋白留出了后续反应位点。 图中央显示携带末端 Br 或 I 的烷基硼酸酯前体经过 BAcED 光反应与 Dha 结合；新的 C–C 键在蛋白侧链近端形成，而末端 C–Br/C–I 仍被保留。下方完整蛋白质谱显示，溴代与碘代产物的实测质量分别为 15,302 Da 与 15,349 Da，与标注的理论值非常接近。左下方的氯代产物为 15,258 Da；结合图中“3 M NaCl、64 h”的箭头可知，氯代侧链还可以通过较慢的卤素交换获得，而不能把这一步误写成与溴、碘前体完全相同的直接安装。图3b｜由中心向右的箭头展示亲核取代产物谱系。 β-巯基乙醇（βME）提供硫亲核试剂，能够在侧链上形成 C–S 键；TCEP 可形成含磷连接；胺类与叠氮试剂可分别形成 C–N 键或含叠氮结构。与图3a 中蛋白侧链自由基的“均裂”转化不同，这些反应主要利用烷基卤化物的亲电性质，通过亲核取代（异裂） 实现侧链后修饰。因此，同一个 Dha 入口可以先被转化为统一的卤代骨架，再分流生成多种功能基团。图3b｜左上角是面向生物学应用的延伸。 带有亲电侧链的蛋白，如果与其结合伙伴形成近距离接触，局部有效浓度会提高，有利于捕获对方可反应的亲核位点。但图3b中的部分小分子衍生需要较高试剂用量或较长时间，不能由此推断所有替换都适合活细胞条件。图3a与图3b合起来的关键结论 是：作者将蛋白新侧链分别设计成可发生均裂反应的自由基前体，或可发生异裂反应的亲电体，真正把蛋白“修饰产物”变成第二轮反应的平台。研究者在组蛋白 eH3.1 的 K18 对应位置，分别安装乙酰化赖氨酸（AcLys）和苯甲酰化赖氨酸（BzLys）侧链，再利用完整蛋白 LC–MS 监测 Sirt2 介导的去酰化过程。两种侧链呈现不同的酶促反应速率，说明化学构建的模型蛋白不仅能用于结构表征，还能够作为去酰化酶的底物，揭示 Sirt2 对酰基结构的选择性。 这一结果对于表观修饰酶研究十分关键。以往只比较不同小分子底物时，难以完全保留蛋白局部环境；而通过位点编辑获得修饰蛋白，可以在相近的蛋白骨架背景下改变特定位点的侧链结构。需要谨慎的是，单一酶学测试证明的是所测试条件下的底物识别与反应，并不等于所有人工安装的 PTM 都与细胞内天然修饰完全等价。在 Lys / AcLys 侧链的 γ 位引入 CF₂ 标记后，底物与去乙酰化产物的局部电子环境不同，因而可在 ¹⁹F-NMR 谱图中被区分。论文进一步利用分辨出的信号观察 Sirt2 反应的时间变化，并分析不同立体异构组分的响应；这类信息是单靠整体分子量变化难以同时得到的。该方法不需要再接入较大的荧光报告基团，但依赖合适的蛋白浓度、样品稳定性及核磁分辨率。图4｜Sirt2 对不同酰化蛋白底物的反应，以及 ¹⁹F-NMR 监测去乙酰化图4a｜先看左侧质谱随时间如何变化。 作者分别在组蛋白 eH3.1 的 K18 对应位点装入乙酰化赖氨酸 AcLys（红）与苯甲酰化赖氨酸 BzLys（蓝），图中上方质谱证实两类蛋白底物被构建。加入去酰化酶 Sirt2 后，下面按 5 min、100 min、12 h 排列的完整蛋白质谱展示底物峰与去酰化产物峰此消彼长。乙酰化底物在较早时间点便出现明显产物，苯甲酰化底物的变化则慢得多；在相同蛋白骨架背景下，这一时间差直接反映出 Sirt2 对酰基类型的选择性。图4a｜为什么“去酰化速度差”具有生物学意义？ 这一结果并不是单纯比较两种游离小分子的反应，而是在相同组蛋白位点上更换不同酰化侧链，再测量酶对它们的处理。由此可以将“蛋白环境”和“酰基结构”两项因素相对分开，说明经化学安装的侧链可以作为酶可识别的研究底物。应注意，图中的时间序列是特定反应体系下的实验读出；不能仅凭一组质谱图推断体内去酰化动力学，也不应把所有人工 PTM 统称为与天然修饰完全等价。图4b｜右侧用 ¹⁹F-NMR 提供另一种追踪方法。 通过 pySOOF 路线，研究者在 Lys/AcLys 侧链 γ 位引入二氟亚甲基（CγF₂）；上方质谱先确认含氟 AcLys 与 Lys 模拟物的安装。下方叠加的 ¹⁹F 谱图在约 −99 至 −97 ppm 一带显示若干可分辨信号：浅蓝色的含氟 AcLys 信号与绿色的去乙酰化后含氟 Lys 信号可区分，反应谱中峰位和峰强的改变用于追踪 Sirt2 催化过程。由于 ¹⁹F 对局部环境敏感，标记虽然不在发生断键的酰基上，也能“读出”附近化学状态的变化。图4b｜还能够看到立体化学层面的信息。 自由基加成到平面的 Dha 双键后，新的 α-碳中心可能产生不同构型，因此安装所得模型蛋白需要考虑立体异构组分。图中分辨出的多组 ¹⁹F 信号说明，核磁读出不止有“乙酰化/去乙酰化”两种化学状态；结合作者的进一步分析，还可以观察 Sirt2 对不同立体异构组分的选择性。这是该含氟探针的一个特色，但峰的具体 D/L 归属与动力学解释依赖论文的谱图分析，不宜仅通过颜色或峰高做独立定量推断。应用三｜通过共价交联定位组蛋白与 KDM4A 的接触区域作者在组蛋白的选定位点安装具有交联能力的 Bhn 侧链，再使其与组蛋白去甲基化酶 KDM4A 相互作用。结合 SDS–PAGE 与胰酶消化后的 LC–MS/MS 分析，研究者捕获并定位到 KDM4A 活性中心附近、参与锌离子结合的半胱氨酸残基。相较于仅观察两种蛋白“是否相互作用”，共价交联可以进一步提供接触区域和邻近残基的信息。这也体现了反应性侧链的另一类用途：在合适位置安装共价“捕捉器”，将原本可能短暂的蛋白结合事件转化为可分离、可鉴定的产物。不过，交联结果仍需结合构象、蛋白序列与其他实验加以解释，不能简单等同于完整的高分辨率复合物结构。图5｜组蛋白与 KDM4A 的共价交联及质谱定位结果图5c｜左边是蛋白间的“近距离共价捕获”模型。 作者在组蛋白 eH3.1 的 4、9、27 位 等位置引入含溴亲电侧链 Bhn，再与组蛋白去甲基化酶 KDM4A 相互作用。若组蛋白的反应手柄在结合状态下靠近 KDM4A 的亲核残基，就可能与其形成共价键；图中用 KDM4A 锌结合区域附近的半胱氨酸作例子。结合胰酶切割后 LC–MS/MS 分析，论文识别到与交联相关的 Cys234、Cys306 等位点，说明交联产物能够为两种蛋白的局部空间接近关系提供化学证据。图5c｜中间的 Zn²⁺ 释放曲线是一条功能性旁证。 KDM4A 的部分半胱idine参与 Zn²⁺ 配位；当亲电侧链与相关巯基发生共价反应时，可能削弱配位并使锌离子释放。曲线中 eH3-Bhn9 处理组的 Zn²⁺ 信号随时间明显上升，而野生型组蛋白、游离前体和空白对照的变化较小。论文图注给出的释放速率分别约为 9.27、0.09、0.81 与 0.87 nM/min，从功能读出上支持 Bhn9 修饰的组蛋白具有不同于对照的反应能力。锌释放是与共价捕获相互支持的证据，而非单独证明精确交联位点的唯一手段。图5c｜右侧 SDS–PAGE 是对共价复合物的直接观察。 凝胶将野生型组蛋白、不同 Bhn 修饰组蛋白与是否存在 KDM4A 进行对照：在相应交联条件下可见高于单独组蛋白或 KDM4A 的新条带（图中标注 Crosslink），与形成分子量更大的复合物相符。把凝胶条带（是否生成高分子量产物）＋LC–MS/MS（哪些残基参与连接）＋Zn²⁺ 释放（锌配位区域是否受到影响） 结合起来，证据链比只看一个凝胶条带更完整。不过，这仍主要证明体外体系中发生了特定位点附近的共价捕获，而不等于得到了复合物所有原子级接触信息。这项工作的核心推进，不只是“能安装多少侧链”，而是建立了化学结构与功能测量之间的联系。 Dha 决定了编辑起点，光氧化还原反应扩展了可用碳骨架，后续均裂与异裂化学又使安装后的侧链具备新的反应能力。三个层次连接起来，才使这套平台能够覆盖 PTM 模拟、酶学研究、核磁检测和蛋白相互作用捕获等应用。但方法的适用范围也必须讲清楚。首先，位点选择性以事先在蛋白上生成 Dha 为前提，通常需要蛋白突变和化学处理；其次，文中的关键验证主要在体外重组蛋白上进行，不能直接推广为活细胞或活体中的任意位点编辑；再次，反应往往需要控制氧气，并根据自由基前体、蛋白及目标产物优化条件。因此，这更是一套功能强大的体外蛋白化学工具，而非已经普适化的细胞内编辑技术。若要走向复杂生物体系，一方面需要发展更易于在细胞环境中使用的定位／反应入口和氧气兼容条件；另一方面也需要系统评估蛋白折叠、非目标修饰、反应产物均一性以及真实生物学功能。这些问题的解决程度，将决定侧链重构方法能在多大范围内从模型蛋白走向实际生物学应用。相关方向在后续研究中继续发展。2024 年《Nature》论文 Direct radical functionalization of native sugars 报道了直接利用未保护天然糖构建糖基自由基相关反应的方法，并将其拓展到预先带有 Dha 的蛋白质，获得翻译后糖基化产物。该工作体现了自由基化学连接糖化学与蛋白编辑的潜力；不过，它采用的是另行发展的糖基化策略，并非 2020 年 BAcED／pySOOF 两套体系的简单延用，两篇论文的具体试剂与反应机理应分别理解。一句话总结： 从“Dha 定位”到“蓝光下 C–C 成键”，再到“修饰蛋白的功能读出”，这项研究为蛋白质侧链的定点构建与反应性设计提供了可扩展的化学平台，也提醒我们：方法学的价值，最终要通过所能回答的生物学问题来体现。[1] Josephson, B.; Fehl, C.; Isenegger, P. G. et al. Light-driven post-translational installation of reactive protein side chains. Nature 2020, 585, 530–537. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2733-7[2] Wright, T. H.; Bower, B. J.; Chalker, J. M. et al. Posttranslational mutagenesis: A chemical strategy for exploring protein side-chain diversity. Science 2016, 354, aag1465. https://doi.org/10.1126/science.aag1465[3] Spicer, C. D.; Davis, B. G. Selective chemical protein modification. Nature Communications 2014, 5, 4740. https://doi.org/10.1038/ncomms5740[4] Jiang, Y.; Wei, Y.; Zhou, Q.-Y. et al. Direct radical functionalization of native sugars. Nature 2024, 631, 319–327. https://doi.org/10.1038/s41586-024-07548-0
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