糖聚合物是一类新的合成高分子，通常是指将单糖或寡糖置于经典的碳碳键聚合物侧链上而构成的聚合物，其合成方法随着高分子聚合方法的发展而不断更新。碳水化合物在糖聚合物制备过程中的保护与脱保护步骤通常会引发聚合物极性的显著变化，然而这一变化在自组装研究中常被忽视。

考虑到在脱保护过程中糖分子会由疏水转变为亲水从而引发糖聚合物的自组装，我们设计合成了由糖单元上带有保护基团的糖嵌段和一个疏水嵌段组成的嵌段共聚物，以期通过极性反转过程获得所需的“糖在内”结构，即具有糖基内核的胶束和具有糖基中间层的囊泡。但是，怎样选择糖单元上的保护基团和疏水嵌段成为新的难题。本文选择聚苯乙烯作为疏水嵌段的原因是其对氢键呈现惰性，不会与脱保护后暴露的糖羟基形成氢键，因此能够确保在整个体系中脱保护行为是唯一的“组装开关”。同时，考虑到乙酰基是最常用和较简单的保护基团，其合成路径和脱保护手段都较为成熟且稳定，并且乙酰基官能团在¹H NMR和FT-IR中都具有明确的特征峰，脱保护后这些信号消失，羟基信号增强，为组装过程提供了清晰、可追踪的光谱证据，我们首先研究了带有乙酰基的糖聚合物脱保护诱导组装过程。

我们首先制备了带有乙酰基保护的甘露糖可聚合单体，再通过RAFT聚合获得第一嵌段为聚苯乙烯、第二嵌段为全乙酰基保护甘露糖的嵌段聚合物(PS-b-PManAc)。由于聚合物上修饰的甘露糖均由乙酰基保护，能够在THF中以单链形式存在。当在上述聚合物溶液中加入脱保护试剂四丁基氢氧化铵(TBAOH)时，甘露糖上的乙酰基被很快脱去，并且该糖基嵌段由疏水性转为亲水性，在THF中的溶解性急剧降低，而聚苯乙烯嵌段在THF中保持了良好的溶解度，使得该聚合物迅速形成组装体。进一步，我们通过冷冻透射电镜(cryoTEM)和动静态光散射研究发现，改变含糖嵌段的长度，聚合物在THF中会形成胶束或空心囊泡等纳米结构。通过这样的设计，我们实现了糖脱保护反应诱导的大分子自组装。

相关研究成果由苏璐等人完成，该工作发表于ACS Macro Letters. (ACS Macro Letters.2014,3, 534−539.)

图1. (a)含糖嵌段聚合度不同时所得到的不同形貌；(b)PS₇₅-b-PManAc₂₅脱保护引发自组装的过程。

脱保护诱导的大分子自组装本质上是一种新型的“化学反应诱导大分子自组装”策略，相比于传统的选择性溶剂自组装以及环境变化诱导的自组装，其具有天然独特的优势，比如可以通过对反应速率的控制调控组装行为。在明确脱保护诱导糖基自组装（DISA）策略的可行性及基础功能后，我们进一步深入探索组装体的形成机制，重点关注脱保护速率这一关键参数对组装体形貌的调控作用，开展了进一步系统性研究。

在上述通过脱除乙酰基保护诱导的自组装过程中，由于脱保护速率太快，其组装过程用已有的检测方法都无法捕捉到。幸运的是，在保护基化学的宝库中，有多种化学结构相近但脱保护速率不同的保护基供我们选择。因此，选择了在相同条件下脱保护速率较慢的苯甲酰基（Bz）作为保护基，合成了Bz保护的乳糖单体，并通过RAFT聚合得到两亲性嵌段共聚物PS₁₁₅-b-PLacBz₁₅ (SbB₁₅)，与之前的乙酰基体系PS₁₁₅-b-PLacAc₁₃ (SbA₁₃)进行对比。通过控制聚合度使所获得的聚合物具有完全相同的PS嵌段和长度非常接近的糖嵌段，因此聚合物之间的区别仅仅来自乳糖分子上的保护基。

那么问题来了，仅仅是保护基不同，最终的组装结果会有区别么？答案是：区别大得惊人。我们针对合成的两种嵌段共聚物SbB₁₅和SbA₁₃进行了脱保护处理，在过量TBAOH (2.5 equiv.)条件下，Bz和Ac都能完全脱保护，最终都形成囊泡（图2）。但是，Bz体系的囊泡尺寸（58 nm）是Ac体系（24 nm）的两倍多，这表明，即使最终的化学结构是相同的，由不同保护基带来的不同脱保护速率也会使最终的组装体尺寸产生巨大差异。

图2. (a) 加入过量TBAOH后，SbB₁₅和SbA₁₃的<Rh>随时间变化；(b) V-Bz-3和V-Ac-3的<Rh>分布；(c)(d) V-Bz-3和V-Ac-3的cryo-TEM

对于另一对具有较短糖嵌段的共聚物，即SbB₅和SbA₇，通过在THF溶液中加入过量的TBAOH也进行了自组装实验（图3）。这对共聚物组装的动力学行为与上述具有长Bz和Ac嵌段的那对非常类似，即<Rh>首先快速增加然后保持稳定。然而，如冷冻透射电镜所显示的那样，SbB₅的脱保护导致了囊泡（V-Bz-4）的形成，而SbA₇的脱保护导致了胶束（M-Ac-4）的形成。这表明，在短糖嵌段下Ac的快速脱保护导致分子来不及形成更高级的囊泡结构，从而被“冻结”在胶束状态；而Bz的慢速脱保护允许体系跨越能垒形成囊泡。

图3. (a) 加入过量TBAOH后，SbB₅和SbA₇的<Rh>随时间变化；(b) V-Bz-4和M-Ac-4的<Rh>分布；(c)(d) V-Bz-4和M-Ac-4的cryo-TEM

上述实验内容均使用过量的脱保护试剂，Bz的脱保护虽然较慢，但也能够很快脱除，但如果我们将脱保护试剂减至刚好够用，又会发生怎样的组装过程？能否真正看清脱保护诱导组装的全过程呢？带着这样的疑问，我们针对两种嵌段共聚物SbB₁₅和SbA₁₃进行了脱保护处理（图4）。在当量TBAOH (1.0 equiv.)条件下，Ac体系仍能保持快速自组装，<Rh>快速稳定在大约22 nm；但是Bz体系的粒径先是快速暴涨至120 nm，然后缓慢攀升至270 nm，最后又迅速回落至50 nm左右稳定下来，这种“长大后再裂变重组的行为”是我们首次捕捉到脱保护诱导自组装的完整三阶段过程。

图4. (a) 加入当量TBAOH后，SbB₁₅和SbA₁₃的<Rh>随时间变化；(b)(c) V-Bz-5和V-Ac-5的cryo-TEM

上述研究成果由吴修龙等人完成，该工作发表于Macromolecules. (Macromolecules.2015,48, 3705−3712.)

在明确了DISA策略的动力学调控规律与精准制备方法后，我们并未止步于有机相的基础研究，而是聚焦生物医用材料的实际应用需求。生理环境多为水相体系，化学试剂触发也难以适配生物体内温和条件，因此我们设想进一步将该策略拓展至更贴近生理场景的水相体系。

为了在水中获得所需的聚合物囊泡，我们通过RAFT聚合和聚合后修饰制备了含有亲水性聚乙二醇（PEG）嵌段、受保护糖嵌段和疏水性聚苯乙烯（PS）嵌段的三嵌段共聚物（图5）。选择PEG是为了稳定溶液中的组装体，而选择PS则是因为其在显微镜下观察形态时具有较高的电子衬度，中间的糖嵌段是作为“变身开关”，能够诱导脱保护引发的形态转变。考虑到细胞表明存在相当丰富的半乳糖受体，我们选择乙酰化半乳糖作为中间糖嵌段，期待其在细胞的免疫激活调节中发挥重要作用。

图5.三嵌段糖聚合物P-Acm-n的制备

为了系统验证脱保护诱导形貌转变的普适性和调控机制，我们设计合成了四种具有低分散度的不同共聚物：P-Ac50-36、P-Ac100-60、P-Ac100-140、P-Ac100-350，其能够统一命名为P-Acm-n（P:PEG，Ac:乙酰基保护的糖嵌段，m:聚合度DP，n:PS嵌段的DP）（图5）。

我们首先对这四种共聚物使用溶剂交换法进行自组装，利用透射电子显微镜（TEM）和动态光散射（DLS）进行了形貌的表征，这四种共聚物均能够形成分散良好的囊泡（图6）。随后对其进行脱保护处理。在我们之前的工作中，脱乙酰化的反应是在THF溶液中使用TBAOH来完成的，但是在本工作中囊泡是在水中形成，也就要求脱保护操作要在水介质中进行。由于NaOH在水中的溶解性较好且脱保护效率高于其他试剂，因此我们选用NaOH的水溶液进行脱保护反应。脱乙酰化后四种共聚物分别表示为P-50-36、P-100-60、P-100-140和P-100-350。

图6. (a) P-Ac50-36脱保护前后的TEM图像；(b) P-Ac50-36脱保护前后的<R_h>分布图

按照传统认知，如果去掉糖嵌段上的疏水保护基，使其变得亲水，囊泡应该倾向于解体或者变小，但令人惊讶的是，以P-Ac50-36为例，DLS检测到脱保护前后其<R_h>值从61nm显著增加到103nm（图6b），这一反常表现激励我们进一步探索脱保护诱导形态转变的机制。随后我们对其脱保护过程进行了监测（图7a）。TEM显示在脱保护过程中囊泡先融合成更大的聚集体，然后重组成胶束。8小时时能看到明显的融合结构，72小时后完全转变为胶束（图7b）。在此，我们提出这种强烈的融合主要是由于乙酰基脱除后暴露的大量羟基所引起的碳水化合物-碳水化合物相互作用（CCI）。为了验证这种猜想，我们在脱保护过程中加入Ca⁺（已知能够介导CCI，导致糖类结合），果然观测到更明显的聚集。

图7. (a) P-Ac50-36脱保护过程中<R_h>值的演变；(b) P-Ac50-36脱保护过程中的TEM图像

在有了以上研究的基础上，我们迫切地想探索这种脱保护诱导地形态转变的生物功能和应用，为了实现这一目标，我们必须使用酶来替代无机碱，使其能够用在活细胞内。在比较不同脂肪酶后，我们选择了来自小麦胚芽的脂肪酶来处理P-Ac50-36囊泡。脂肪酶天然存在于细胞溶酶体中，能够催化酯键水解。通过DLS和TEM追踪形态转变，显示脂肪酶催化的脱保护与NaOH催化的脱保护过程具有相似的机制，即囊泡向胶束的转变（图8）。这意味着，不需要外加任何试剂，只需要把囊泡送进细胞，溶酶体内的脂肪酶就能够自动触发“变身”。

图8. (a) 脂肪酶催化脱保护诱导形态转变的机制示意图；(b) 加入脂肪酶后P-Ac50-36脱保护过程中的TEM图像

上述研究成果由齐文静等人完成，该工作发表于J. Am. Chem. Soc. (J. Am. Chem. Soc. 2018, 140, 8851–8857.)

如果说上述工作的核心是“脱掉保护基”，那么后续工作的关键词变成了“加上糖单元”——我们首次尝试使用糖基转移酶作为触发剂，在糖肽组装体中原位构建新的糖苷键，实现了形貌的精准转变。要实现这个目标，首先需要一个合适的受体分子，它必须同时满足两个看似矛盾的要求。首先，受体分子必须含有特定的糖残基，从而确保其能够被糖基转移酶识别；其次，受体分子本身需要具有足够强的组装驱动力，使其能够在水相中形成规整结构。因此，我们设计合成了一个精巧的分子，在L-酪氨酸（Y）的N-端连接疏水的芴甲氧羰基（Fmoc, F）基团，并在C-端连接单糖GlcA，希望能够将GlcA组装成具有蛋白聚糖模拟形状的纤维结构（图9）。此处的Fmoc部分不仅是肽合成中的普通保护基，同时也是用于功能材料的简单仿生构建模块。同时，在侧链引入芳香族部分能够与Fmoc产生协同效应，形成π-π相互作用，从而赋予整个分子强大的组装能力。

图9.修饰有蛋白聚糖残基的糖肽的化学酶法合成路线

随后，我们通过将GlcA-YF以1 mg/mL的浓度溶于水并超声10分钟来制备组装体。利用透射电子显微镜（TEM）监测GlcA-YF的自组装过程，观察到立即形成小颗粒并随着时间的延长形成短纳米纤维（图10）。我们通过TEM和原子力显微镜（AFM）仔细表征了纳米纤维的详细结构，它表现为直径为10 nm、高度约为7±0.2 nm、螺距为45 nm的左旋螺旋（图11）。

图10. GlcA-YF自组装过程的TEM图像

图11. GlcA-YF组装成的纳米纤维的微观尺度表征。(a) 负染色后的TEM显微图；(b) 水溶液中的AFM显微图；(c) 通过AFM测量的纳米纤维的高度（红线）和螺距（蓝线）图；(d) 图11b中方框内局部放大图

天然聚糖是在特定糖基转移酶的催化下，通过将单糖部分组装成线性和分支的聚糖链来合成的，这启发我们在由GlcA-YF组成的纳米纤维上进行糖基化。我们尝试在纤维溶液中加入UDP-GalNac和KfoC酶，或者加入UDP-GlcNac和PmHS2酶，使酶在纤维表明加上新的糖单元。结果是令人惊喜的，当受体处于组装态时，酶促反应能够发生，虽然速率显著变慢。KfoC催化下，单分子态受体3小时反应完全，而组装态受体需要50小时才达到70%转化率（图12）。这说明有序排列限制了分子运动，减少了有效碰撞。TEM监测显示，随着反应进行（转化率61%），纤维开始断裂成短片段，同时出现纳米颗粒；反应完全后（转化率100%），纤维完全消失，变成直径约22 nm的纳米颗粒（图13）。至此为止，我们完成了首次用糖基转移酶实现糖肽组装体的形貌转变。

图12. KfoC催化生成GalNacGlcA-YF时受体处于单体状态和组装状态的催化效率图

图13.不同转化率下原位生成GalNAcGlcA-YF过程中形态转变的TEM显微图

上述研究成果由杨静等人完成，该工作发表于ACS Macro Letters. (ACS Macro Letters.2020,9, 929−936.)

类似于这一思路，我们还采用糖苷酶，即切除糖苷键的天然酶作为“触发剂”，实现了糖基脱除引发的自组装形貌转变。研究发现，这一“脱糖”过程的动力学快慢会显著影响最终产物的形貌——当唾液酸被缓慢切除时，初始的双螺旋纤维逐渐解离为纳米球；而当切除速度较快时，纤维则倾向于横向融合，演化为扭曲的纳米带。借助这种酶促“减法”策略，我们不仅能够在体外模拟细胞表面唾液酸动态调节的过程，还有望实现对细胞黏附行为的调控，为构建酶响应的仿生材料提供了新的思路。相关工作由曾雅等人完成，发表于高分子学报2022, 1-9.