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文献嗑学| 人工凝聚体增强活细胞中目标mRNA的翻译
今天要分享的这篇文献发表于今年《Nature Chemistry》，题目是“合成生物分子凝聚物来增强活细胞中目标RNA的翻译”。通讯作者是杜克大学的Ashutosh Chilkoti教授，他长期研究类弹性蛋白多肽（ELP）等仿生材料，并在2020年成功设计了能在活细胞内形成液滴的人工固有无序蛋白。而这一次，他们更进一步——用人工凝聚体实现了对基因翻译的正交调控，并发现：同样的相分离系统，在体外模型中抑制翻译，而在活细胞里会增强翻译。
要理解这项工作的巧妙之处，得先从“液液相分离LLPS”说起。这个概念并不新：上世纪20年代，科学家Bungenberg就观察到带相反电荷的聚合物（例如带正电的明胶与带负电的阿拉伯胶）会自发相分离，形成高浓度的液滴相和低浓度的稀溶液相，并将这种富集聚合物的液滴称之为“凝聚体”（Coacervates）。而这项基础性的研究，为同时期的苏联科学家奥巴林的生命起源理论提供了关键灵感。在学界尚未知晓DNA是双螺旋结构和没有电子显微镜的时代，奥巴林就提出了极具远见的假说：他预言在地球早期的“原始汤”中，这种无需脂质膜包裹的凝聚体液滴，极有可能充当了生命演化进程中最原始的原细胞模型。在随后的几十年里，液液相分离的理论被逐渐建立，如在高分子物理中我们学过的Flory–Huggins溶液理论等，但此后LLPS一直停留在高分子物理的研究范畴内，在生物学界并没有引起太大的波澜。
在很长一段时间内LLPS被视为生物化学实验中的“杂质”或“沉淀”。直到2009年，Anthony Hyman实验室在《Science》上发表了关于线虫胚胎中P颗粒具有液体特性的论文1。他们发现，线虫发育初期，富含RNA和蛋白质的P颗粒最初均匀分布在胚胎中；随着胚胎极化，这些P颗粒会神奇地聚集到细胞后部，它们会相互融合、像液体一样滴落。光漂白恢复（FRAP）实验证实了其内部极高的分子扩散系数，证明了细胞内存在高度动态的、液态的无膜区室。这一结果彻底颠覆了以往认为蛋白质聚集体都是不可逆固相沉淀的传统观点。图3.线虫胚胎中P颗粒在胚胎极化过程中融合（左），P颗粒像液体一样滴落（中），对P颗粒进行FRAP实验（右）1 此后，这个领域迎来了井喷式的发展，科学家们发现细胞内到处都是这种液滴。到了2017年，Anthony Hyman和Michael Rosen等发表了一篇大综述，正式提出了“生物分子凝聚体”这个概念2。我们熟悉的经典细胞器（如内质网或高尔基体）是由脂质双层膜界定的区室结构，通过特殊的膜转运机制调控生命活动；而生物分子凝聚体是没有脂质膜包裹的微米级区室，例如细胞核内的核仁、以及细胞质中的应激颗粒（stress granules）和生殖颗粒（germ granules）等。由于没有脂质层的物理屏障，它们没有完全与环境隔离，依靠LLPS机制在特定位置自发聚集并富集特定的蛋白质和核酸分子。至此，科学家们统一将“无膜细胞器”纳入到相分离的框架下，回应了奥巴林当年预言的“凝聚体”概念。 这些生物分子凝聚体形成的核心机制是多价相互作用。简单来说，当大分子带有多个结合位点时，它们在溶液中会自发交联，组装成网络从而发生相分离。在细胞内，主要有两类网络在驱动这一过程：第一类是包含“模块化结构域”的蛋白，它们依靠不同模块之间高亲和力进行特异性的结合；第二类是含有“内在无序区”的蛋白（IDRs），这些区域缺乏固定的三维结构，依靠大量微弱的、瞬时的非特异性作用力相互黏附，如阳离子-π相互作用、静电相互作用以及偶极作用等。因为这些作用力是“多价”的、且“微弱而短暂”，使得凝聚体在高度浓缩的同时，依然展现出液体般的高动态性。 以本篇文献的研究对象——核糖核蛋白颗粒（RNPGs）为例。RNPGs是由固有无序蛋白和目标mRNA组成的生物分子凝聚体，如P小体、应激颗粒等，它们可以对RNA的生化反应进行时空控制，包括RNA剪接、RNA运输和基因表达等。通过LLPS相分离，既可以凭借物理位阻将mRNA隔离从而抑制翻译，也可以利用凝聚体内局部高浓度效应显著放大翻译效率3。 在过去的十年里，科学家们主要致力于“观察和解析”细胞内天然存在的凝聚体；近年来，领域内开始尝试利用底层的物理化学规律，通过LLPS设计人工凝聚体。利用底层的物理化学规律，通过LLPS设计人工凝聚体 Chilkoti教授在2020年就开展了人工凝聚体的相关工作4。他们设计了一个人工固有无序蛋白（A-IDPs）。这种蛋白具有温度响应性：降温时会形成小液滴并逐渐融合，升温时液滴又会缩小并溶解，呈现典型的上限临界溶解温度（UCST）行为。在人类细胞和细菌内部，他们成功重现了液滴的形成，并且通过升降温循环和序列设计，实现了相变过程的可逆和可调。图5. A-IDPs在囊泡及大肠杆菌中展现出的UCST行为4 为了进一步验证这种液滴的功能，研究团队进行了三步验证：首先是招募小分子，他们在液滴蛋白序列中插入了带有叠氮基团的非天然氨基酸，当向大肠杆菌溶液中加入荧光分子染料时，染料能穿透细胞膜精准进入液滴内部发生“点击化学”反应；其次是招募大分子蛋白质，他们使用“拆分GFP”技术，让液滴蛋白带着GFP的一个小碎片，而细胞质里游离着另一块碎片，一旦液滴形成，游离的碎片就会被吸入液滴内部，拼装成完整的GFP并发出绿光；最后是验证其对酶反应的催化加速效果，他们发现没有液滴时酶反应几乎不发光，而有了人工液滴后，荧光率先在红色液滴内部爆发并迅速让整个细胞变亮，证明了这种人工液滴是一个微型生化反应器，通过在局部空间高度富集酶和底物，极大加速了生化反应的速率。 但仅仅实现加速酶反应还没有达到复刻生命体功能的水平，因此在此基础上，他们进一步考虑是否能在人工凝聚体内实现对基因翻译的时空调控，从而构建一个人工核糖核蛋白颗粒（RNPGs）。图6. A-IDPs的功能验证：招募小分子（左）、招募蛋白质（中）、加速酶催化反应（右）4 下面进入这篇文献的核心内容。首先介绍一下设计元件ELP。ELP是受弹性蛋白原的疏水结构域启发，通过提取这个疏水片段而设计出的蛋白质聚合物(VPGXG) n，其中X是可调节的客体残基，n是聚合度。不同于2020年工作中的UCST蛋白，ELP表现出下限临界溶解温度（LCST）特征，即低于相变温度时可溶，而高于该温度时则发生相分离。Chilkoti教授从2000年开始研究ELP至今，已能通过序列设计、链长调控及溶液条件调整，实现对其相变行为的精确调控和预测。而且采用基因工程技术，可将ELP与其他功能蛋白融合并精准合成，使其成为一种多功能的工程平台。 在本项工作中，为了实现正交的翻译调控，作者设计了一个模块化融合蛋白：Pum2-ELP。其中Pum2是人类RNA结合蛋白的一个结构域，能特异性结合八核苷酸序列（PRS）；ELP则是一种人工固有无序蛋白，具有典型的LCST行为。即便将ELP融合Pum2蛋白，当体系的温度高于其浊点温度或饱和浓度时，Pum2-ELP仍会自发发生LLPS，形成人工凝聚体5。通过表面等离子共振技术（SPR）等实验证明，Pum2-ELP与单独PRS RNA序列的结合力很强（平衡解离常数KD=4.8 nM），并且与整合了sfGFP蛋白真实编码和PRS序列的长链mRNA存在慢结合、难解离的双相特征。 在体外的原细胞模型中，这套系统确实能形成凝聚体并特异性隔离带有PRS标签的目标mRNA。随后，他们进一步研究了这种隔离对mRNA翻译过程的影响。在体系中加入无细胞转录翻译（IVTT）混合物后，进行真实基因翻译实验，结果发现：对于没有PRS标签的mCherry组，随着时间的推移，整个液滴充满了目标蛋白的红色荧光，说明翻译在正常进行；而带有PRS标签的实验组中，红色荧光被显著抑制，说明一旦mRNA被转录出来，就会立刻被融合蛋白捕获并物理隔离，从而抑制了翻译。图8. 在原细胞模型中目标蛋白质mCherry翻译结果
然而，当把同样的系统转移到大肠杆菌中，结果发生了戏剧性的反转。他们使用双质粒诱导系统，先诱导mRNA转录，再诱导Pum2-ELP-GFP融合蛋白表达。活细胞成像显示，融合蛋白呈浓度依赖性地发生相分离，从均匀分布逐渐聚集成巨大的绿色荧光液滴。更关键的是，带有PRS标签的mCherry表达水平显著高于无标签对照组——也就是说，在活细胞里，被凝聚体捕获不但没有抑制翻译，反而增强了翻译效率。图9. 在大肠杆菌中融合蛋白和目标蛋白质mCherry翻译结果 面对体内外截然相反的现象，作者首先验证了活细胞中的凝聚体确实是高度动态的液态。在含有两个凝聚体的细胞中，对一个凝聚体进行光漂白处理，记录漂白后凝聚体的GFP强度、同一细胞内未漂白凝聚体的强度，以及邻近细胞中凝聚体的强度作为对照。结果发现：漂白后凝聚体强度迅速恢复，同一细胞内另一个凝聚体的强度在漂白后立即开始下降，说明凝聚体具有高度流动性，呈现类液态特征；并且同一细胞内两个凝聚体之间的GFP强度快速达到平衡，说明融合蛋白分子并非局限于单一凝聚体，而是可以在凝聚体之间快速交换。图10. 荧光漂白恢复（FRAP）与荧光漂白损失（FLIP）联合实验 接着，他们排除了“增强翻译只是因为mRNA被保护免于降解”的可能性。ELISA定量证实带标签组蛋白产量确实更高；RNA测序则显示，带标签的目标mRNA在凝聚体中丰度约为无标签组的两倍，但全细胞裂解液中的总mRNA丰度无显著差异——说明并非降解减少，而是翻译效率本身提高了。测序数据还意外发现，凝聚体不仅富集目标mRNA，也富集了融合蛋白自身的mRNA以及其他相关蛋白的RNA。 基于这些证据，作者提出了一个简洁而深刻的生物物理模型：决定凝聚体功能的关键在于 转录与翻译是否偶联 。他们指出，在大肠杆菌这样的原核生物中，转录与翻译过程是高度偶联的：一旦RNA开始转录，核糖体立刻会附着在RNA上，即便RNA转录还未完成；而一旦RNA转录完成并暴露出PRS标签，就会立刻被人工凝聚体捕获，同时附着在RNA上的核糖体以及相关的物质都会被一并捕获。因此增强翻译的结果就非常容易理解了——这与2020年工作中提出的微型反应器理念相同：由于目标RNA、核糖体等在人工凝聚体中高浓度富集，从而加速了翻译效率。这一过程正如天然RNPGs的经典功能。而在体外无细胞（IVTT）体系中，他们所选的T7 RNA聚合酶转录效率非常高，是活体系统的8倍，导致转录与翻译过程的解耦合：核糖体还没来得及附着和翻译，RNA已经被大量转录，一旦转录完成，就被高亲和力的人工凝聚体捕获，导致负责翻译的核糖体被物理隔离，从而抑制了翻译效果。 这项工作不仅成功在活细胞中重构了人工核糖核蛋白颗粒，为合成生物学提供了一套纯物理、正交的翻译调控工具，更重要的是，它用一个相反的实验结果揭示了生命系统的底层逻辑：同样的相分离系统，其功能取决于转录-翻译的时空偶联程度。 正如作者在文末所言：这提醒我们，从体外重构到活细胞应用，生物学复杂性往往会带来意想不到的反转。同样的分子，在不同的背景下可以发挥截然相反甚至对立的功能。当我们试图将体外重构的合成生物学系统移植到活细胞中时，不能简单地将试管里的结论外推。活细胞是一个高度拥挤、高度动态、多重过程偶联的非平衡系统，其整体行为往往不是各部分行为的简单加和。生命系统远比我们想象的复杂，而这些“意外”恰恰是推动我们重新理解生命本质的真正动力。- Brangwynne, C. P.; Eckmann, C. R.; Courson, D. S.; Rybarska, A.; Hoege, C.; Gharakhani, J.; Jülicher, F.; Hyman, A. A. Germline P granules are liquid droplets that localize by controlled dissolution/condensation. Science 2009, 324 (5935), 1729-1732.
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