|
文献磕学| ROCK策略助力冷冻透射电镜解析RNA结构
今天分享的文献是由Peng Yin教授和Maofu Liao教授团队于2022年在《Nature Methods》上发表的文章《Sub-3-Å Cryo-EM Structure of RNA Enabled by Engineered Homomeric Self-assembly》。在这篇文章中，作者提出了一种基于RNA工程化自组装的新型策略（RNA Oligomerization-enabled Cryo-EM via Installing Kissing-Loops，ROCK），在一定程度上突破了冷冻透射电镜技术解析小RNA结构的核心瓶颈，为RNA结构生物学研究提供了一种新的技术路径。结构生物学的核心目标是通过解析生物大分子的近原子级分辨率结构，阐明其功能机制，进而为生命过程的理解与相关药物的开发提供基础。著名物理学家费曼曾指出，对生物过程的理解本质上依赖于对分子层面的精细观测。传统透射电镜技术在观测生物大分子时，存在真空脱水、电子辐照损伤、重金属染色导致结构失真等问题，难以保留生物大分子，如蛋白质的天然构象。冷冻透射电镜技术的出现有效解决了这一问题，该技术通过快速冷却将样品中的水转化为无定形玻璃态冰，完整保留生物分子的天然构象，同时低温环境可降低电子辐照损伤，为生物大分子的高分辨率成像提供了可能。单颗粒分析技术是当前冷冻电镜解析生物大分子结构的核心方法，该技术通过采集大量同质性生物分子的二维投影图像，经算法重构获得三维结构，其核心逻辑是通过统计平均提升信噪比，进而实现高分辨率重构。该技术在蛋白质结构解析领域已取得广泛应用，但在应用于RNA分子时面临显著挑战。RNA分子的结构解析长期以来是结构生物学领域的难点，现有技术路径难以直接迁移，具体而言，冷冻电镜解析RNA存在三大核心限制：一、分子量限制：多数功能性小RNA分子量不足100kDa，信号强度不足导致信噪比极低，难以实现颗粒的精准对齐；二、构象异质性：RNA分子具有较高的构象柔性，干扰二维分类过程，无法获得均一的样品群体；三、信号强度不足：RNA的电子散射信号较弱，传统方法需要采集超大规模的数据集，部分研究需超过200万初始颗粒，仍难以获得足够清晰的密度图以完成原子建模。针对上述瓶颈，研究团队提出了名为ROCK的新型策略，其核心是通过工程化改造诱导RNA分子实现同源自组装。具体而言，研究人员在目标RNA的非功能外周区域，引入特异性的kissing-loop序列，该序列可通过分子间碱基配对实现相互作用，同时其天然的120度夹角可诱导RNA分子自组装形成同源寡聚环结构。该改造一方面提升了样品的有效分子量，解决了小分子量带来的信噪比问题；另一方面，组装过程有效限制了RNA分子的构象柔性，提升了样品的均一性，完美适配了冷冻电镜单颗粒分析的技术需求。研究团队首先以嗜热四膜虫组I内含子TetGI为研究对象进行方法验证。TetGI是一种经典的自剪接核酶，其结构解析对理解RNA催化机制具有重要意义。研究人员通过序列改造，成功构建了TetGI的二聚体与三聚体同源寡聚体，并通过冷冻电镜解析其结构。结果显示，TetGI-DS二聚体的整体分辨率达到2.98Å，核心催化区域分辨率可达2.85Å，首次实现了该RNA分子所有结构域的完整解析，可清晰分辨碱基、磷酸骨架以及天然结合的镁离子。功能验证结果表明，该改造未影响RNA的催化活性，改造后的寡聚体保留了原有的自剪接功能。此外，研究还捕捉到了剪接反应后产物结合态与解离态两种构象，还原了天然的产物解离过程，为理解该核酶的催化动力学提供了全新的证据。基于该高分辨率结构，研究还发现了一系列此前未被观测到的结构细节，包括修正了此前预测错误的碱基配对、识别了全新的三级相互作用、阐明了镁离子在剪接反应中的具体功能，深化了对I类内含子催化机制的理解。图5由RoCK实现的TetGI-DS（一种TetGI的二聚体）的亚3埃分辨率冷冻电镜图谱为验证该方法的普适性，研究团队将该策略应用于更小的RNA分子，如针对仅206个核苷酸、分子量70kDa的Azoarcus I类内含子，该方法不仅成功解析了其高分辨率结构，还捕捉到了剪接后的两种功能构象，这是晶体学技术难以实现的；针对更小的、仅112个核苷酸、35kDa的FMN核糖开关，研究也成功获得了初步的结构信息，清晰识别了配体结合口袋。上述结果证明，ROCK策略对小RNA分子具有良好的普适性。图6将ROCK策略应用于两种较小结构的RNA的解析结果综上，该研究提出的ROCK策略，通过工程化的同源自组装，有效解决了冷冻电镜解析小RNA结构的核心瓶颈，既提升了样品的有效分子量、解决了信噪比问题，又限制了RNA的构象柔性、优化了样品均一性。该方法的建立为小RNA的结构解析提供了高效的技术路径，将为RNA功能研究、RNA药物开发等领域提供重要的技术支撑。[1] Zhang K, et al. Sub-3 Å cryo-EM structure of RNA enabled by engineered homomeric self-assembly[J]. Nature Methods, 2022, 19(5): 585-594.[2] Xu R, et al. Three-dimensional coordinates of individual atoms in materials revealed by electron tomography[J]. Nature Materials, 2015, 14: 1099–1103.[3] Xu Y, et al. Intermolecular channels direct crystal orientation in mineralized collagen[J]. Nature Communications, 2020, 11: 5068.[4] Weissenberger G, et al. Understanding the invisible hands of sample preparation for cryo-EM[J]. Nature Methods, 2021, 18: 463–471.[5] Mortimer S, et al. Insights into RNA structure and function from genome-wide studies[J]. Nature Reviews Genetics, 2014, 15: 469–479.
|
