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课题组和麻省总医院-宋彬团队︱一种合成唾液酸糖肽作为定义明确的无异种来源基质支持中脑多巴胺能细胞分化
帕金森病（Parkinson’s disease, PD）以黑质多巴胺能神经元进行性丢失及纹状体运动环路功能障碍为主要病理特征。近年来，基于干细胞来源中脑多巴胺能细胞（mDACs）的细胞移植疗法为重建PD病人受损神经环路、改善运动症状提供了新的治疗策略，并已在早期临床试验中展现出良好前景。然而，其临床转化仍受限于细胞产品制备过程中质量一致性、安全性及功能成熟度等问题。为满足临床应用和GMP生产要求，体外分化体系需采用无动物源性材料作为细胞外基质（Extracellular matrix, ECM），以降低病原体污染、免疫原性和批次差异等风险。目前常用的聚-L-鸟氨酸/纤连蛋白/层粘连蛋白（poly-L-ornithine /fibronectin/laminin，P/FN/LN）培养体系依赖来源于小鼠肿瘤基底膜的层粘连蛋白，存在安全性和临床转化局限。因此，开发成分明确且无异种来源的新型胞外基质材料，成为帕金森病细胞治疗临床应用中的关键挑战。鉴于唾液酸在中枢神经系统发育中的重要作用及其参与神经元迁移和成熟等过程，探索基于唾液酸的新型胞外基质材料具有重要研究意义。针对该问题，课题组联合麻省总医院宋彬教授课题组通过设计合成一系列由唾液酸乳糖和苯丙氨酸组成的唾液酸糖肽超分子纳米纤维体系，为构建面向帕金森病细胞治疗的新一代临床级细胞制造体系提供了新的材料策略。研究通过系统比较系列唾液酸糖肽超分子结构、纳米力学性质及体外支持mDACs分化的能力，成功鉴定出候选材料SL-4F。进一步将其与聚-L-鸟氨酸和纤连蛋白组合形成P/FN/SL-4F培养体系，实现了对传统层粘连蛋白体系的有效替代，并在体内外验证了其良好的分化效率和安全性。机制研究表明，SL-4F可能通过唾液酸介导的L1家族黏附分子相互作用，促进细胞黏附、存活、增殖和成熟。首先，本研究探究了唾液酸相关分子在mDACs分化过程中的表达变化，并评估唾液酸乳糖作为培养基质对分化的支持作用。研究发现，L1家族细胞黏附分子（如L1CAM、CHL1等）及多种唾液酸转移酶（如ST3GAL2、ST6GAL2、ST8SIA2等）在分化过程中显著上调，其中免疫染色发现CHL1与酪氨酸羟化酶（TH）阳性细胞共定位，提示唾液酸信号通路参与调控mDAC分化（见下图1）。且研究发现在无层粘连蛋白条件下，补充3′-唾液酸乳糖（3′SL）可显著改善细胞黏附、存活及分化效果。图1. mDAC分化过程中唾液酸相关分子的上调。(a) hPSCs体外定向分化为mDACs的时序分化方案示意图。分化第15天，将细胞重新接种至不同基质上进行进一步的mDAC诱导。(b)与第0天（人胚胎干细胞，hESCs）相比，L1家族成员（L1CAM、CHL1、NrCAM和NFASC）在分化第15天和第21天mDACs中的相对mRNA表达水平。(c)免疫细胞化学图像显示第21天mDACs中标志物TH与L1家族细胞黏附分子CHL1的表达。比例尺，50 µm。(d)与成纤维细胞相比，hESCs及第21天mDACs中唾液酸转移酶的相对mRNA表达水平。基于3′SL缺乏纤维结构的局限性，研究选取了SL-2F、SL-3F和SL-4F三种唾液酸糖肽，系统比较其自组装行为、纳米力学性能及理化特征。透射电镜结果显示，三者形成不同超分子结构：SL-2F为片状有序原纤维，SL-3F为长而柔韧的纤维，SL-4F则形成扭曲纳米带。通过均方位移分析和持续长度（Lp）测定，发现SL-4F最柔韧，更接近天然层粘连蛋白网络的力学特性。且SL-4F富含β-折叠结构，表现出独特的组装模式。综上，SL-4F在结构仿生和力学适配性上最具优势，为后续作为mDAC分化的基质材料提供了实验依据（图2）。图2. 唾液酸糖肽自组装体的结构及纳米力学特征。(a) SL-2F、SL-3F和SL-4F的化学结构及示意图，以及SL-3F和SL-4F自组装结构的代表性透射电镜图像。比例尺，100 nm。(b)三种组装体的均方位移（MSMD）曲线，显示其为轮廓长度的函数。(c)基于MSMD拟合获得的持续长度（Lp）的统计分析。(d)比较三种唾液酸糖肽二级结构的圆二色谱（CD）光谱。随后，研究评估了三种唾液酸糖肽（SL-2F、SL-3F、SL-4F）作为功能性ECM成分替代层粘连蛋白支持mDACs分化的效果。将P/FN分别与三种唾液酸糖肽联用，发现P/FN/SL-4F组细胞产量显著高于传统P/FN/LN组，且细胞形态健康、增殖良好。同时，在细胞凋亡检测和分化效率方面P/FN/SL-4F组与P/FN/LN组表现相当。在三种唾液酸糖肽中，SL-4F可有效模拟层粘连蛋白的基质支持功能，在支持mDAC存活和分化方面表现优异，是一种有前景的化学成分明确的替代基质（图3）。图3. SL-4F联合多聚鸟氨酸和纤连蛋白支持mDAC分化。(a) hPSCs体外定向分化为mDACs的流程示意图。(b)不同基质上分化第16天和第21天mDACs的相差显微镜图像。比例尺，100 µm。(c)不同基质组间第21天mDACs的细胞总产量（n = 4）。(d)免疫细胞化学分析显示不同基质组分化第21天mDACs中TH和CC3的表达。比例尺，100 µm。(e-f)不同基质组分化第21天mDACs中CC3和TH阳性细胞的定量分析（n = 3）。(g-h)不同基质组分化第21天mDACs中TH的蛋白质印迹分析及相应的统计结果（n = 4）。(i)不同基质上分化第0天和第21天mDACs中TH的相对mRNA表达水平（n = 4）。此外，研究还系统鉴定了P/FN/SL-4F新基质组合下分化的mDAC在体外和在体均具有有效性和安全性，且机制研究提示SL-4F可能通过结合L1家族分子并调控细胞表面唾液酸化活性来支持mDAC分化。总之，我们在唾液酸糖肽候选物中鉴定出SL-4F为最优，其作为一种成分明确、无异源成分且成本效益高的层粘连蛋白替代基质，可有效支持mDAC分化。经优化的P/FN/SL-4F基质策略能够可靠地支持体外mDAC的高效、安全分化，并保持其移植后的功能与安全性。本研究为开发成分明确的合成替代基质以取代动物源性基质提供了有力的理论框架，且为基于简单、明确组分构建下一代生物材料平台的设计提供了新见解，有望推动帕金森病细胞疗法的临床转化。该研究成果近日发表在ACS Nano上 ，并申请了相关专利。文章题目：A Defined Xeno-Free Matrix Supports Midbrain Dopaminergic Cell Differentiation链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsnano.6c04239。本研究由复旦大学陈国颂教授和麻省总医院宋彬教授为共同通讯作者，复旦大学脑科学转化研究院博士生王甜、高分子系博士生曾雅、复旦大学华山医院薛俊博士为共同第一作者。高分子系刘荣营博士(现工作于瑞典斯德哥尔摩大学化学系)为本研究做出了开创性贡献。高分子系李龙老师和脑科学转化研究院程田林老师提供了有力支撑。研究始于2020年，历时6年，合作双方都经历了多位同学参与，期间宋老师辗转上海和波士顿，依靠合作双方的信任与坚持，终于得以完成。
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